3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒说明书
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 25 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×3 支 | -20℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解后待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2、 试剂三：临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3、 试剂四：临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
5、 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。
产品说明：
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起 340nm 处的吸光度下降，即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
血清/血浆：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定：(在1mL石英比色皿分别加入下列试剂)
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
工作液 | 900 | 900 |
样本 | | 100 |
蒸馏水 | 100 | |
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃ （哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱5min，拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） |
三、PGK活性计算
1、按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PGK（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
2、按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PGK（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
3、按照液体体积计算
酶活单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PGK（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T=321.54×ΔA
4、按照细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PGK（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.643×ΔA
V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：500 万个细胞；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1. 、ΔA 大于 0.8 或者 A1 测定小于 0.9 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min 或 15min）或增加样本体积来测定。
2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。
3、样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
