ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒
微量法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
提取液二 | 液体 1 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂一 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体 15 μL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 500 μL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
2、 试剂三：临用前加入 2 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3、 试剂四：临用前加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
4、 试剂五：临用前加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
5、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。
产品说明：
ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶，其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料，并可参与相关重要蛋白的修饰作用，是体内能源物质代谢的枢纽性物质。
在ATP和辅酶A存在的情况下，ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐,，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、天平、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰盒。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（104 个）︰提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min），于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。
3、血清（浆）或其他液体：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂一置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min。
3、 操作表 (在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入下列试剂) ：
| 测定管 | 空白管 |
试剂一（μL） | 161 | 161 |
试剂二（μL） | 4 | 4 |
试剂三（μL） | 20 | 20 |
试剂四（μL） | 4 | 4 |
试剂五（μL） | 1 | 1 |
样本（μL） | 10 | - |
蒸馏水（μL） | - | 10 |
在微量石英比色皿/96 孔UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1， 迅速置于 37℃水浴/ 25℃（其它物种）或培养箱 2min（酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃），拿出迅速擦干测定 130s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定，ΔA空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管（空白管只需做 1-2 次）。 |
注意：如果样本量大，可按试剂一︰试剂二︰试剂三︰试剂四︰试剂五=161︰4︰20︰4︰1 的比例配制成工作液使用，工作液应根据样本量现配现用。
三、ACL活性计算
A、按微量石英比色皿计算：
- 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位
ACL 活性（U/mg prot）=[ΔA×V 反总×109÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL 活性（U/g 质量）=[ΔA×V 反总×109÷（ε×d）]÷(W×V 样÷V
