3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒（微量法）
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 12 μL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为 3:100 的体积比例充分混匀，现用现配；
2、 工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量 37℃（哺乳动物）或 25℃
（其它物种）预热 10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
产品说明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3-二磷酸甘油酸和NADH 生成 3-磷酸甘油醛、无机磷和 NAD+，340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GAPDH 活性的高低。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释 或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴， 功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、 操作表（在微量石英比色皿或 96 孔板中分别加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
样本（μL） | | 6 |
蒸馏水（μL） | 6 | |
试剂三（μL） | 4 | 4 |
工作液（μL） | 190 | 190 |
在微量石英比色皿/96 孔UV 板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm 处测定10s 时的吸光值A1， 迅速置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴或培养箱 5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或 25℃），拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2 次） |
三、GAPDH 酶活计算：
A、按石英比色皿计算：
- 按蛋白浓度计算
酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
酶活定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T=1072×ΔA÷W
- 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每 104 个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（500×V 样÷V 样总）÷T=2.14×ΔA
- 按液体体积计算
酶活定义：每 mL 样本每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH 酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷V 样÷T=1072×ΔA
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.0002L；V 样：反应体系中样本体积，0.006mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：5min；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数， 1mol=109nmol。
B、按 96 孔 UV 板计算：
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、 当 A1 小于 0.8 或 ΔA 大于 0.7 时（96 孔板为 A1 小于 0.4 或 ΔA 大于 0.4），建议将样本稀释后再进行测定。
2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.02。
