4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（4CL）活性检测试剂盒说明书
微量法
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 3 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液：内含不溶物，使用前摇匀；
2、 试剂二：临用前加入 3 mL 蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3、 试剂四：临用前用 4 mL 蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；
4、 试剂五：加入 1 mL 乙醇溶解，临用前用蒸馏水稀释 40 倍后备用，现用现配；
5、 工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1 的比例配制工作液，现用现配。
产品说明：
4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶 A 酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，其在 333nm 下测有特征吸收峰，测定 4-香豆酸 CoA 的生成速率，即可反映 4CL 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。
2、 操作表（在 0.5mL EP 管中进行下列操作）：
| 测定管 | 空白管 |
样本（μL） | 20 | - |
蒸馏水（μL） | - | 20 |
工作液（μL） | 80 | 80 |
试剂一（μL） | 100 | 100 |
充分混匀后测定 333nm 下的初始值 A1，37℃反应 1h 后再次测定吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定管-A1 测定管，ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 |
三、4CL活性计算
A、按微量石英比色皿计算：
- 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每 mg 组织蛋白每小时生成 1nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=476.19×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位定义：每 g 组织每小时生成 1nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。4CL（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=476.19×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算：
单位定义：每 1 万个细菌或细胞每小时生成 1nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。
4CL（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.9124×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×104 L/mol/cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B、按 96 孔 UV 板计算：
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔 UV 板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、 若 ΔA 大于 0.5，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。
