6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 60 mL×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前配制，加入 2.2 mL 试剂一，混匀；
2、 试剂三：临用前配制，加入 2 mL 试剂一，混匀。
产品说明：
磷酸戊糖途径途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）依次催化 NADPH
合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。
6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清粗酶液，待测。
二、测定步骤
- 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 340nm，蒸馏水调零。
- 试剂一置于 37℃水浴预热 30min 以上。
- 加样表（在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入）
试剂名称（μL） | 测定管（μL） | 空白管（μL） |
样本 | 20 | - |
蒸馏水 | - | 20 |
试剂一 | 140 | 140 |
试剂二 | 20 | 20 |
试剂三 | 20 | 20 |
于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 0s 吸光值记为 A1，第 180s 吸光值记为 A2。记 ΔA 测定=A2 测定-A1
测定，ΔA 空白=A2 空白-A1 空白。
三、6PGDH 活性计算
a、使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、 按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/mg prot) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样)÷T
=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
2、按样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/g 质量) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.0002L；Cpr： 粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3min；W：样本质量，g。
b、使用 96 孔板测定的计算公式如下
1、 按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/mg prot)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样)÷T
=893×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
- 按样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/g 质量) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=893×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；V 反总：反应体系总体积，0.0002L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3min；W：样本质量，g。
注意事项：
- 试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在 4℃，可保存 1 周。
- 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；
- 若样本初始（0s）读值大于 0.5 且 ΔA 测定小于 0.1，可尝试将样本进行稀释后测定。
使用96孔板测定时，可根据样本数量将试剂一（预热后）、二、三预混为工作液，因是根据反应速率计算酶活， 为保证每个样本的反应时间尽量一致不推荐同时测过多样本。
