6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）活性检测试剂盒
紫外分光光度法
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前配制，加入 5 mL 试剂一，混匀；
2、 试剂三：临用前配制，加入 5 mL 试剂一，混匀。
产品说明：
磷酸戊糖途径途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）依次催化 NADPH合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。
6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清粗酶液，待测。
二、测定步骤
- 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 340nm，蒸馏水调零。
- 试剂一置于 37℃水浴预热 30min 以上。
- 加样表：在比色皿中依次加入
试剂名称（μL） | 测定管（μL） | 空白管（μL） |
样本 | 100 | - |
蒸馏水 | - | 100 |
试剂一 | 700 | 700 |
试剂二 | 100 | 100 |
试剂三 | 100 | 100 |
于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 0s 吸光值记为 A1，第 180s 吸光值记为 A2。记 ΔA 测定=A2 测定-A1
测定，ΔA 空白=A2 空白-A1 空白。
三、6PGDH 活性计算
1.按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/mg prot) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×109×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T
=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
- 按样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。6PGDH 酶活性(U/g 质量) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×109×V 反总]÷(W÷V 样总×V 样)÷T
=536×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.001L；Cpr： 粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.1mL；V 样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；W：样本质量，g。
注意事项：
- 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；
- 试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在 4℃，可保存 1 周。
- 若样本初始（0s）读值大于 0.5 且 ΔA 测定小于 0.1，可尝试将样本进行稀释后测定。
