L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Gal LDH）活性检测试剂盒
微量法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 110 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
- 试剂一：临用前加入 16 mL 蒸馏水，充分溶解；
- 试剂二：临用前加入 2 mL 蒸馏水，充分溶解产品说明：
L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步， 也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。
Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素C(Cyt c)，还原型Cyt c在550nm有吸收峰；测定还原型Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃离心 10min，取上清液置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。
2、 按样本数取出一定量的试剂一在25℃水浴锅中预热30 min以上，其余的分装保存(-20℃)。
3、 空白管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL预热的试剂一和20μL试剂二，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值，分别为A1，A2，ΔA空白管=A2-A1。
4、 测定管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂一和20μL试剂二，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值，分别为A3，A4，ΔA测定管=A4-A3。
三、Gal LDH 活性计算
- 使用微量比色皿测定的计算公式如下
- 按蛋白浓度计算：
Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH（U/mg prot）=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.289×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
- 按样本质量计算
Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH（U/g 质量）=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.289×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε： 还原型Cyt c摩尔消光系数， 17.3×103L/mol/cm； d： 比色皿光径， 1cm； V反总： 反应体系总体积， 0.2mL=0.0002L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。
- 使用96孔板测定的计算公式如下
- 按蛋白浓度计算
Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。Gal LDH (U/mg prot) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=0.482×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
- 按样本质量计算
Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。 Gal LDH (U/g 质量) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.482×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε： 还原型Cytc摩尔消光系数， 17.3×103L/mol/cm； d： 96孔板光径， 0.6cm； V反总： 反应体系总体积， 0.2mL=0.0002L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。
注意事项：
1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 25℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中；若使用 96 孔板，反应期间应放入 25℃培养箱中。
2、建议两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定 OD 值。
