产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 110 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 工作液的配制：一瓶试剂二用 10 mL 试剂一溶解。现用现配。
产品说明：
漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一种环保型酶，其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。
漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水，水浴锅
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、培养液：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 420nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、水浴锅温度调至 45℃。
3、操作表：在微量玻璃比色皿/96 孔板中分别加入下列试剂：
样本名称 | 测定管 | 空白管 |
样本（μL） | 30 | |
蒸馏水（μL） | - | 30 |
工作液（μL） | 170 | 170 |
在微量玻璃比色皿/96 孔板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 420nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 45℃水浴 3min，拿出迅速擦干测定 190s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管= A2 测定-A1 测定，ΔA 空白管=A2空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2 次） |
三、漆酶活性计算
- 按微量玻璃比色皿：
- 按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×Cpr）÷T=61.7×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×W÷V 样总）÷T=61.7×ΔA÷W
- 按细胞数量计算
酶活定义：每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×500÷V 样总）÷T=0.123×ΔA
- 按液体体积计算
酶活定义：每 mL 液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T=61.7×ΔA
ε：ABTS 摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，2×10-4L；V 样：反应中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W， 样本质量，g；T：反应时间，3min；500：细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
- 按 96 孔板计算：
将上述计算公式中的 d-1cm 换为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1、工作液需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。
2、测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，OD 值变化不超过 0.05。
