丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 0.6 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 15mL×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 25mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂六 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂七 | 液体 8mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
- 试剂二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。
- 试剂六：每支试剂六加入 1mL 蒸馏水溶解备用。
- 工作液的配制：临用前把 11.5mL 试剂四、一支试剂五、0.9mL 试剂六、3.5mL 试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂-20℃分装保存，可以保存 4 周。
产品说明：
PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH 催化丙酮酸脱氢， 同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm 光吸收的减少。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4 ℃ 11000g
离心 10min，取上清，置冰上待测。
细胞或者细菌样本：先收集 500 万细胞到离心管内，离心后弃上清；之后加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二， 冰浴超声波破碎细菌（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 5 min）；然后 11000g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤
- 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。
- 每个样本需要 900μL 工作液，按样本数+1 取出一定量的工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）中孵育 5min。
- 空白管：在 1mL 比色皿中加入 900μL 工作液和 50μL 水，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值 A2，计算 ΔA 空白=A1-A2。
- 测定管：在 1mL 比色皿中加入 900μL 工作液和 50μL 样本，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值 A3 和 1min后的吸光值 A4，计算ΔA 测定=A3-A4。
三、PDH 活性计算
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性（U/mg prot）=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=904.762×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
2、按样本质量计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性(U/g 质量)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=913.81×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
3、按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性(U/104 cell)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=1.828×(ΔA 测定-ΔA 空白)
4、按样本体积计算
单位的定义：每 mL 液体每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/mL)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=904.762×(ΔA 测定-ΔA 空白)
V 反总：反应体系总体积，9.5×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L/mol/cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05mL；V 样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，1min；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
注意事项：
1、 测定过程中所有样本在冰上放置并于 2 小时内检测，以免变性和失活。
2、测定管的ΔA 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的ΔA 值大于 0.25，需将样本进行稀释。
3、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去本身的蛋白含量。
