一氧化氮（NO）含量检测试剂盒说明书微量法
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 110 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体 3 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
显色液 A 液 | 液体 10 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
显色液 B 液 | 液体 10 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体 1mL×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：粉剂置于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水混匀，-20℃分装保存两周，避免反复冻融；
2、 显色液：临用前按照实验所需用量按 A 液：B 液=1:1 充分混匀，现配现用；
3、 标准品：10μmol/mL 亚硝酸钠。
产品说明：
一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，常温下为气体，微溶于水， 具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，作为一种新型的生物信使分子，在细胞间及细胞内发挥传递信号的作用。其广泛分布于生物体内各组织中，特别是神经组织中。在机体神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中也起着十分重要的作用。
NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO -和NO -，本法利用硝酸还原酶特异性将NO -还原成NO -，在酸性条件下，NO -与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。
技术指标：
最低检出限：0.00074 μmol/mL
线性范围：0.00078-0.25 μmol/mL
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
- 组织样本：按质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10 比例（建议称取 0.2g 样本，加入 1.0mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后，于 4℃，12000rpm，离心 15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
- 细胞样本：按细胞数量（104）：提取液体积（mL）500~1000 : 1 的比例（建议 1000 万细胞加入 1.0mL 提取液） 加入提取液，冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），然后于 4℃，12000rpm， 离心 15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
- 液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、将试剂一置于冰上备用。
3、标准液的稀释：将标准品用蒸馏水倍比稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL标准液。
4、标准液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度（μmol/mL） | 标准液体积（μL） | 蒸馏水体积（μL） | 稀释后浓度（μmol/mL） |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 200 | 800 | 0.2 |
3 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
4 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
5 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
6 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
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