植物花色苷含量试剂盒说明书

微量法

测定意义：

花色苷是一类易溶于极性溶剂的天然色素，属黄酮类化合物。花色苷广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，使其呈现由红到紫等不同颜色，是植物主要的呈色物质。

测定原理：

采用pH示差法测定花色苷含量，当pH为1.0时花色苷在530nm处有最大吸收峰,而当pH为 4.5时,花色苷转变为无色查尔酮形式,在530处无吸收峰, 利用此特性分别测定在不同pH下的 530nm和700nm处的吸光度值。pH示差法减少了溶液pH和溶剂差异的影响，排除了其他非花色苷类物质对检测结果的干扰。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100 mL× 1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20 mL× 1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 20 mL × 1 瓶，4℃保存；

花色苷的提取：

按照烘干样品质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g烘干样品，加入1mL提取液），充分匀浆后转移到EP管中，提取液定容至1mL，盖紧后 4℃浸提24 h，8000g，常温离心10min，取上清液待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上；试剂一和试剂二预热10min以上；

2、取20μL上清液和180 μL试剂一（相当于稀释10倍），静置15min，分别测定530nm和700nm处的吸光值，分别记为A1和A2。

3、取20μL上清液和180μL试剂二（相当于稀释10倍），静置15min，分别测定530nm和700nm处的吸光值，分别记为A3和A4。

4、计算△A=(A1-A2)-(A3-A4)

注意：如果A1大于1，可以适当加大稀释倍数，保证总体积200 μL不变，如10 μL上清液和190 μL试剂一（相当于稀释20倍）；如果A1小于0.1，可以适当缩小稀释倍数，保证总体积不变，如100 μL上清液和100 μL试剂一（相当于稀释2倍），使A1保持在0.1~1范围内，可提高检测灵敏度；同样调整上清液和试剂二体积比例；计算时以实际稀释倍数代入下述公式中。

花色苷含量计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

花色苷含量（μg/g 干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×10⁶]÷W=16.7×ΔA×F÷W

V：提取液体积，1×10^-3L；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；M：花色苷的相对分子质量：449.2g/mol；F：稀释倍数；10⁶：1g=10⁶μg；W：样本干重：g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

花色苷含量（μg/g 干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×10⁶]÷W=33.4×ΔA×F÷W

V：提取液体积，1×10^-3 L；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；M：花色苷的相对分子质量：449.2g/mol；F：稀释倍数；10⁶：1g=10⁶μg；W：样本干重：g。

注意：最低检测限为 0.2μg/g 干重