中性转化酶（NI）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 50mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 35 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 30mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存；
2、标准品：10mg 葡萄糖，临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，制备 10mg/mL 葡萄糖标准液备用。
产品说明：
蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。NI 主要存在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。
NI 催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有特征光吸收，在一定范围内 540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min，调节波长至540mm，蒸馏水调零。
2、标准品的制备：将标准品用蒸馏水稀释成1.0、0.8、0.6、 0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液，
4、操作表（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
样本 | 200 | 200 | - |
试剂一 | - | 800 | - |
试剂二 | 800 | - | 800 |
标准液 | - | - | 200 |
混匀，37℃准确水浴30min后，煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变），12000 g，4℃离心5min，取上清。 |
上清 | 900 | 900 | 900 |
试剂三 | 500 | 500 | 500 |
混匀，煮沸 10min 左右（盖紧，以防止水分流失），流水冷却后充分混匀，540nm 处蒸馏水调零，记录各管吸光值 A，ΔA=A 测定-A 对照。
三、NI 活性计算
1、标准曲线的建立：
以各浓度下吸光值减空白管（浓度为0mg/mL）的吸光度为y轴，葡萄糖浓度为x轴绘制标准曲线。根据标准曲线，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。
2、NI活性计算：
- 按样本蛋白浓度计算
单位定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性（U/mg prot）=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3 ×x÷Cpr
- 按样本质量计算
单位定义：37℃每 g 组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性（U/g 质量）=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3 ×x÷W
1000：单位换算系数，1 mg/mL =1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V2：加入提取液体积，
1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间：30min。
注意事项：
1、如果加入试剂三，煮沸 10min 后有混浊物出现，建议离心除去沉淀后，取上清测定吸光度。
2、如果吸光值大于 1，可以用蒸馏水将样本稀释后测定（计算公式中乘以相应稀释倍数）。
3、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
