糖原磷酸化酶 b (GPb)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法

产品内容：

溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；2-8℃保存 2 个月；
2、试剂三：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；
3、试剂四：临用前加入 1.25mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；
4、试剂五：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；
5、试剂六：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；
6、试剂七：临用前加入 4 mL 蒸馏水，充分混匀后-20 分装保存 4 周，避免反复冻融；
7、工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四 =740μL: 20μL: 20μL:20μL（1T 的量）的比例，充分混匀，现用现配。
产品说明：
糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶 a
（Glycogen phosphorylase a, GPa）和无活性的糖原磷酸化酶 b（Glycogen phosphorylase b, GPb）两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶 a 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH， 在 340nm 下测定NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。添加激活剂测定GP（GPa 和GPb）总活性， 未添加激活剂时测定 GPa 活性，GP 活性-GPa 活性得到GPb 活性。
在 340nm 下测定NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。

Gpa (without activator) Phosphoglucomutase

Glycogen Glucose 1-Phosphate Glucose 6-Phosphate
(Gpa+Gpb) (add activator)

G6PDH

Glucose 6-Phosphate 6-Phosphogluconolactone + NADPH (340nm)
NADP+
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、电子天平、可调式移液器、研钵/匀浆器、1 mL 石英比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。
2、血清（浆）：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。
3、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，蒸馏水调零。
2、工作液置于 37℃预热 5min。
3、GPa 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 蒸馏水、800 μL 工作液， 立即混匀并计时，记录 340 nm 下 10s 时吸光值A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGPa=A2-A1。
4、GP 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 试剂七、800 μL 工作液， 立即混匀并计时，记录 340 nm 下 10s 时吸光值A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGP=A4-A3。
三、糖原磷酸化酶 b (GPb)活性计算
1. 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPb（U/mg prot）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷Cpr
2. 样本鲜重计算
单位定义：每g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPb（U/g 鲜重）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=32 1.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷W
3. 按样本体积计算
单位定义：每 mL 液体每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位
GPa（U/mL）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷V 样÷T=321.54× (ΔAGP-ΔAGPa)
4. 按细胞数量计算
单位定义：每 1 万个细胞每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPa（U/104 cell）=[(ΔAGP-ΔAGPa) ×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷( 细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa)÷细胞数量
V 反总：反应体系总体积，1×10 -3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计；109：1mol=109nmol。
注意事项：
1、如果测定吸光值 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加反应中的样本体积或者样本质量后再进行测定。