丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 45 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体 50μL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前每支加入 1.5mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂仍 4℃保存一周；
2、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:20 的体积比例充分混匀， 冰上放置备用，现用现配；
3、工作液的配置：临用前将试剂二转移至试剂一中，充分溶解待用，现配现用。
产品说明：
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+， 在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或者 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、将工作液、试剂三置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）预热 10 分钟。
3、加样表：
试剂名称（μL） | 测定管 |
工作液 | 900 |
试剂三 | 30 |
试剂四 | 15 |
样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。
三、PK 活力单位的计算
- 按血清（浆）PK体积计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。PK（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷V样÷T=2613×ΔA
- 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。PK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷(Cpr×V样)÷T=2613×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。PK（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷(W×V样÷V样总)÷T=2613×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。PK（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷(500×V样÷V样总)÷T=5.226×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.75×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：
1、测定过程中试剂四、样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度尽量保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
