碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 35mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 50mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 10mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 液体 1mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解；
2、试剂二：临用前加入 10mL 提取液，沸水浴中搅拌溶解。
3、标准品：20μmol/mL 标准酪氨酸。
产品说明：
AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在 680nm 有特征吸收峰，测定 680nm 吸光度增加速率，来计算 AKP 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP 管、冰 和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
3、标准溶液的配制：临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL 标准溶液使用，现用现配。
4、样本测定：(1.5mLEP管中分别加入下列试剂)
试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
粗酶液 | 100 | 100 | | |
试剂一 | 200 | |
试剂二 | | 200 |
混匀后40℃水浴保温10min |
试剂一 | | 200 |
试剂二 | 200 | |
混匀后10000rpm 4℃离心10min，取上清 |
上清 | 200 | 200 | | |
蒸馏水 | | | 200 | |
标准品 | | | | 200 |
试剂三 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
试剂四 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀后40℃水浴保温20min |
取1mL于1mL玻璃比色皿中，于680nm测定光吸收，分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。并计算ΔA测定=A测定管-A对照管、ΔA标准=A标准管-A空白管。
三、碱性蛋白酶活性计算
1、按蛋白浓度计算
酶活单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1 μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性（U/mg prot）=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷（Cpr×V2）÷T=0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义：40℃每克样本每分钟催化水解产生 1 μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性（U/g 质量）=C 标准品<
