亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：临用前加入 5 mL 丙酮溶解。
产品说明：
LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。
LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、液体：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。
2、 加样表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
试剂一 | | 50 |
样本上清 | 50 | |
试剂一 | 850 | 850 |
试剂二 | 100 | 100 |
在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃ 水浴3min，拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A2测定-A1测定，ΔA空白管=A2空白-A1 空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 |
三、LAP酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T=675.4×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V样÷V样总) ÷T=675.4×ΔA÷W
3、按细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。LAP（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.35×ΔA
4、按液体体积计算：
单位的定义：每mL液体每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷V样÷T=675.4×ΔA
V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103L/mol /cm；109：单位换算系数， 1mol=109nmol；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需单独测定；W：样本质量，g；500：细胞总数，500万。
注意事项：
1、ΔA大于0.5时或者A值大于1.5时建议将样本上清用试剂一稀释后再进行测定。
2、空白管的ΔA变化小于0.01。
