果胶裂解酶（PL）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂一：溶液中如果有沉淀存在，可以 50℃水浴助溶。
产品说明：
果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛，主要来源于微生物，在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义，在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。
果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰，测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、恒温水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、培养液：直接测定
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 235nm，蒸馏水调零。
2、操作表：(在 1.5mL 离心管中)
试剂名称 | 测定管 | 空白管 |
试剂一（μL） | 900 | 900 |
酶液（μL） | 100 | - |
蒸馏水（μL） | - | 100 |
充分混匀后测定 235nm 下的初始值 A1，40℃反应 30min 后再次测定吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定管-A1 测定管，ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 |
三、果胶裂解酶活性计算
蛋白浓度计算
1、酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr
2、按照样本质量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 64.1×ΔA÷W
3、按照细菌、真菌数量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每 104 个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 64.1×ΔA÷细胞数量
4、按照培养液体积计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T= 64.1×ΔA
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.001L；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T： 反应时间，30min；109：换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、若 ΔA 大于 0.5，将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。若 A 测定管大于 1.5 时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3、空白管正常情况下变化不超过 0.02。
