木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 85mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 11mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 6mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
产品说明：
木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。Lip 在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。
藜芦醇可以被 Lip 催化发生氧化反应，其产物藜芦醛在 310nm 处有最大吸收峰，以藜芦醇为反应底物，通过测定 310nm 处藜芦醛的吸光值，可以判定 Lip 的酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为 1:5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），10000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
3、培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 310nm，蒸馏水调零。
2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三置于 37℃预热 10min 以上。若一次性测定样本过多， 可根据使用量将试剂一、二、三按 6:2:1 比例配成工作液后进行预热，测定时按照 100μL 样本+900μL 工作液加入 1mL 玻璃比色皿进行测定。
3、加样表（在 1mL 玻璃比色皿中依次加入下列试剂)：
试剂名称（μL） | 测定管 |
试剂一（μL） | 600 |
试剂二（μL） | 200 |
样本（μL） | 100 |
试剂三（μL） | 100 |
将上述试剂分别加入 1mL 玻璃比色皿后迅速吹打混匀，从加完最后一个试剂开始计时，记录第 15s 的吸光值 A1，将混合液置于 37℃水浴锅/恒温培养箱培养 5min，取出测定 5min15s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1， 注意保证测定时间的准确性。
三、Lip 活力的计算
1、按样本蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃，pH4.5 条件下，每 mg 组织蛋白每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性（U/mg prot）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义：37℃，pH4.5 条件下，每 g 组织每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性（U/g 质量）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T=215.05×ΔA÷W
3、按细菌/细胞数量计算
酶活定义：37℃，pH4.5 条件下，每 104 细菌/细胞每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性（U/104 cell）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T=215.05×ΔA÷细胞数量
4、 按照样本体积计算
酶活定义：37℃，pH4.5 条件下，每 mL 血清或液体样本每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。Lip 活性（U/mL）=ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷V 样÷T=215.05×ΔA
ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d:比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.001L；V 样：加入样本体积，0.1mL，V 样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5 min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
