糖原合成酶（GCS）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 45 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 15 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 40 μL×1 支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂五 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂六 | 液体 115 μL×1 支 | 2-8℃保存 |
试剂七 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂八 | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂四：提供一个 5 mL 试剂瓶，用前取 1 支加入 3mL 试剂一充分溶解，-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
2、试剂五：提供一个 5 mL 试剂瓶，用前取 1 支加入 3mL 试剂一充分溶解，-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
3、工作液的配制：临用前将试剂三离心，取 20 μL 试剂三，加 14 mL 试剂一、3 mL 试剂四、3mL 试剂五， 充分混合（约 26T），现用现配，也可根据样本量按比例配制；
4、试剂八的配制：
（1） 临用前取 1 瓶试剂八中加入 6mL 试剂二充分溶解，再将 1 支试剂七转移到试剂八中混合溶解后待用，可-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
（2） 用前先将试剂六离心，取 55 μL 试剂六加入 5.74 mL 上述（1）中溶液，充分混合（约 28T），现用现配，也可根据样本量按比例配制。
产品说明：
糖原合成酶（Glycogen synthase , GCS）将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端，以α-1,4糖苷键连接。GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶，同时也是胰岛素作用的主要靶酶，在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD+， 在340 nm下测定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。
GCS
UDPG + [Glucose]n UDP + PEP
PK
[Glucose]n+1 + UDP UTP + Pyruvate
LDH
Pyruvate + NADH (340nm) + H+ NAD+ + Lactic acid
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（104 个）:提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
血清等液体：直接检测。（若溶液浑浊则离心后取上清进行测定）
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、临用前将工作液与试剂八置于37℃水浴锅中预热5min（工作液用多少预热多少）。
3、操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：
试剂名称（μL ） | 空白管 | 测定管 |
样本 | | 50 |
蒸馏水 | 50 | |
工作液 | 750 | 750 |
试剂八 | 200 | 200 |
加入样本即开始计时，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值A1 和 1min 10s 时的吸光值A2， 计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管（空白管只需做 1-2 次）。 |
三、GCS 酶活计算
1. 按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10 9÷（V样×Cpr ）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9÷（V样×W÷V 样总）÷T =3215.4×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9÷（V样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T
= 3215.4×ΔA÷细胞数量（万个）
4. 按液体体积计算
酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9÷V 样÷T =3215.4×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol； V反总：反应体系总体积，1×10 -3L；V样：反应体系中样本体积，0.05mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间：1min。
注意事项：
1、样本提取上清液置于冰上待测，提取样本建议当天测完。
2、若ΔA大于0.2，建议将样本用提取液稀释适当倍数后测定，以提高检测灵敏度，并在计算公式中乘以相应的稀释倍数。
