乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法

溶液的配制：

1、提取液：临用前将试剂九加入到提取液中，并于 4℃保存；

2、试剂二：临用前每瓶加入 4 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

3、试剂三：临用前每瓶加入 3 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

4、试剂四：临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

5、试剂五：临用前每支加入 1 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存：

6、试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 43:457（V:V）的比例配制备用，现用现配；

7、试剂七：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按 1:9（V:V）的比例配制备用， 现用现配；

8、试剂八：临用前加入 5 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；

9、工作液：吸取 0.3 mL 试剂二、1 mL 试剂三、0.65 mL 试剂四、0.2 mL 试剂五、0.2 mL 试剂六、0.2 mL

试剂七、1 mL 试剂八混匀，也可根据比例现用现配，于冰上备用。

产品说明：

ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP 和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或细胞处理：

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。

3、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 3 分钟； 迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 3 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA 测定=A 测定 1-A 测定 2，ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2，计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

三、ACK活力计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=536×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V提取×W) ÷T=536×ΔA÷W

1. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V提取×500) ÷T=1.072×ΔA

1. 按血清体积计算：

单位的定义：每mL血清（浆）中消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=536×ΔA