DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品内容：

溶液的配制：
1、试剂一：无水乙醇自备；
2、试剂二：粉剂置于瓶内 EP 管中。临用前加入 6.08 mL 试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存 1 个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V）= 4：21 的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于 2-8℃保存一周；
3、试剂三：10 mg 维生素 C。临用前加入 1 mL 提取液，充分振荡溶解，配成 10 mg/mL 维生素 C 溶液，2-8℃ 保存两周；用于阳性对照。
产品说明：
DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。
DPPH 自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在 515 nm 处有强吸收。当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm 的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除 DPPH 自由基的能力。

Antioxidants

DPPH? DPPH?H

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50 目筛和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
（1） 植物样本的制备：将新鲜样本置于 60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过 30~50 目筛。称取约 0.05 g 样本，加入 1 mL 提取液，40℃水浴浸提 30 min。室温 10000 rpm 离心 10 min，取上清，置冰上待测。

（2） 红酒、果汁等液体样本：吸取 100 μL 样本溶液加入 900 μL 提取液，旋涡振荡混匀，室温 10000 rpm 离心 10 min，取上清，置冰上待测。
（3） 提取物或者药物：可用提取液配制成一定浓度，如 5 mg/mL。
注意：不同样本清除 DPPH 自由基的能力可能相差很大，为保证实验结果的准确性，样本要根据预实验结果进行适当调整（如清除率大于 90%，建议将提取的样本用提取液进行稀释；清除率小于 5%，建议加大烘干样本质量或液体样本体积进行提取）。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 515 nm，无水乙醇调零。
2、阳性对照的准备：若需要线性关系，建议将 10 mg/mL 的维生素 C 溶液用提取液配制成 0.3、0.25、0.125、
0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 的维生素 C 溶液待用，稀释可参考下表；若需要清除率约为 100%的阳性对照， 则建议将 10 mg/mL 维生素 C 溶液用提取液配制成大于 0.3 mg/mL 的维生素 C 溶液待用。

备注：实验中每个标准管需 25μL 试剂三。
3、操作表：在 1.5 mL EP 管中分别加入下列试剂