细胞色素 b5（Cytochrome b5）含量检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品内容：

溶液的配制：
1、试剂一：临用前取一瓶加入 50mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂 4℃可保存 4 周；
2、工作液配制：临用前取一瓶试剂三，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，缓慢加入 30mL 试剂二，充分溶解，4℃避光可保存 1 周。
产品说明：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素 P450 和细胞色素 b5 是 P450 酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与 P450 代谢活性密切相关。
氧化型细胞色素 b5 经连二亚硫酸钠还原后，在 424nm 处有最大吸收峰，通过测定 424nm 和 490nm 处吸光值的差异，即可计算出细胞色素 b5 的含量。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、超速离心机、恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g，4℃离
心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃
上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加 0.5mL 试剂二，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，置于冰上待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 424nm 和 490nm，蒸馏水调零。
2、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 蒸馏水、1000μL 工作液，室温静置 2min，分别测定 424nm 和 490nm处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 空白管 1，490nm 处吸光值记为 A 空白管 2。计算 ΔA 空白管=A 空白管 1-A 空白管 2。注：空白管只需做 1-2 次。
3、测定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 待测液、1000μL 工作液，室温静置 2min，分别测定 424nm 和 490nm
处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 测定管 1，490nm 处吸光值记为 A 测定管 2。计算 ΔA 测定管=A 测定管 1-A 测定管 2。
三、细胞色素 b5 含量计算
（1） 按蛋白浓度计算
细胞色素 b5 含量(nmol/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷（Cpr×V 样）
= 122.8×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
（2） 按样本质量计算
细胞色素 b5 含量（nmol/g 质量）= (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W
= 61.4×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W

ε：还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数，171×10-6 L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm； V 反总：反应体系总体积，1.05 mL；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，50 μL=0.05 mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量，g。
注意事项：
1、如果测定吸光值 A＞1.2 或 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2、如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。