硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测试剂盒说明书 微量法

产品组成：

溶液的配制：

1、试剂三：临用前取 1 支加入 1.667 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃保存 1 周。

2、试剂四：临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释 10 倍后使用。

产品说明：

TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH， 是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成TNB 和 NADP+，TNB 在 412nm 有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与 DTNB同样能反应生成 TNB，因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定 412nm 波长处TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一） 进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待检测。

2、细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

注：测定前将上清液与试剂四以50：1的体积比混匀（即取100μL上清液加入2μL试剂四混合）37℃水浴30min

后至冰上。

2、试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。

3、空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，160μL 试剂一，迅速混匀后于 412nm

测定 10s 时的吸光度，37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度记为 A1 和 A2。计算 ΔA 空白管=A2-A1。

4、测定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 试剂二，20μL 试剂三，140μL 试剂一，20μL 上清液，迅速混匀后于 412nm 测定 10s 时的吸光度，37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度，记为 A3 和 A4。ΔA 测定管=A4-A3。

三、TrxR活性计算

1. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/mg prot）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d) ×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷Cpr

1. 按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/g 质量）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d) ×109×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷W

1. 按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。TrxR（U/104 cell）=（ΔA测定管-ΔA空白管）÷（ε×d）×109×V 反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷细胞数量

ε：TNB在 412nm 处的摩尔消光系数，1.36 ×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积， 200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；细胞数量：以 104 为单位，万个；109： 单位换算系数，1mol=109 nmol。

1. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃ 或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/mg prot）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d) ×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

=245×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷Cpr

1. 按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/g 质量）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d) ×109×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=245×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷W

1. 按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。