NADP 磷酸酶（NADPase）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 液体 20 mL×1 瓶 | 常温保存 |
标准品 | 液体 1 mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：用时加入 1.5 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。
2、试剂三：用时加入 20 mL 双蒸水，溶解后 4℃可保存一周。
3、试剂四：用时加入 20 mL 双蒸水，溶解后 4℃可保存一周。
4、标准品：10 mmol/L 标准磷贮备液。将标准品 20 倍稀释，即取 0.5 mL 标准液加 9.5 mL 蒸馏水，充分混匀，配制成 0.5 μmol/mL 标准磷应用液。
5、定磷试剂的配制：按 H2O：试剂三：试剂四：试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色， 若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷试剂根据实验用量现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
产品说明：
NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿、匀浆器/研钵和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：称取约0.1g样本，加提取液1.0 mL充分研磨，于4℃，8000g离心10min，取上清液置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、操作表：酶促反应
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 300 | 300 |
试剂二 | 100 | |
蒸馏水 | | 100 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min |
样本 | 100 | 100 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min后，沸水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，
10000g常温离心10min，取上清。
3、定磷：
试剂名称（μL） | 标准管 | 空白管 | 测定管 | 对照管 |
0.5μmol/mL标准磷应用液 | 100 | | | |
蒸馏水 | | 100 | | |
上清液 | | | 100 | 100 |
定磷试剂 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀，37℃水浴30min，冷却至室温，在660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值，记为A标准管、A空白管、A测定管、A对照管，并计算ΔA标准=A标准管-A空白管，ΔA测定=A测定管-A对照管。（空白管和标准管只要做1-2 次）
三、NADPase酶活性计算
1、 按组织蛋白浓度计算：
定义：规定每分钟每毫克组织蛋白中NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。
NADPase (U/mg prot) =ΔA测定÷
