肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前加 10 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2、试剂二：临用前加入 0.5 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3、试剂三：临用前取 1 支加入 0.5 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4、试剂四：临用前加入 0.65 mL 蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
5、工作液：临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以 70:4:7:10:90 的比例混合（体积比）。现用现配。使用前室温孵育 20min（该步骤不可省略）。
产品说明：
肌酸激酶（Creatine Kinase，CK） (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶，主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中， 能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。
CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加，以此来表示CK酶活。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液） 进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2、血清样本：直接测定。
3、细胞样本：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液）加入提取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g 离心10min，取上清待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。
2、操作表：在1mL比色皿中加入下列试剂
| 空白管 | 测定管 |
样本（μL） | | 200 |
工作液（μL） | 450 | 450 |
H2O（μL） | 550 | 350 |
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴3min，拿出迅速擦干测定190s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A2测定-A1测定，ΔA空白管=A2空白-A1 空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） |
三、CK 活性计算
1、 按组织蛋白浓度计算：
酶活定义：37℃，pH7.0 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。CK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr
2、 按组织样本质量计算：
酶活定义：37℃，pH7.0 时，每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。CK活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样÷V样总×W) ÷T =268×ΔA÷W
- 按血清体积计算：
酶活定义：37℃，pH7.0 时，每mL血清每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。CK活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷V样÷T=268×ΔA
- 按细胞数量计算：
酶活定义：37℃，pH7.0 时，每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。CK活性（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T= 268×ΔA÷细胞数量
ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V 样：反应体系中样本体积，0.2mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 细胞数量：以104为单位，万个；T：反应时间，3min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、血清的CK不稳定，采集样本后尽快测定，4℃避光保存可稳定24h。
2、样本蛋白质含量需要另外测定。
3、OD 值大于 0.6 可用提取液适当稀释样本，并在计算公式中相应的改变稀释倍数。
4、ΔA 空白管一般不超过 0.01。
