NADPH-细胞色素 C 还原酶（NCR）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 80mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取一瓶加入 50mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂 4℃保存可保存 4 周；
2、试剂三：临用前取一瓶加入 1.3mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融。
3、试剂四：临用前取一支加入 275μL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。
产品说明：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为 P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。
NCR 催化 NADPH 还原氧化型细胞色素 C，还原型细胞色素 C 在 550nm 处有特征吸收峰；通过测定 550nm
吸光度的增加速率，来计算 NCR 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、恒温培养箱/水浴锅、低温离心机、超速离心机、研钵/匀浆器、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g，4℃离
心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃
上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加 0.5mL 试剂二，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。
2、临用前根据实验用量取出部分试剂二在 37℃水浴中预热 30min。
3、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 蒸馏水、900μL 试剂二、50μL 试剂三和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，测定第 10s 和第 130s 吸光值，分别记为 A1、A2。计算 ΔA 空白=A2-A1。空白管只需做 1-2 次。
4、测定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50μL 粗酶液、900μL 试剂二、50μL 试剂三和 10μL 试剂四，迅速混匀
后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，测定第 10s 和第 130s 吸光值，分别记为 A3、A4。计算 ΔA 测定=A4-A3。
三、NCR 活性计算
1、按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。NCR ((nmol/min /mg prot)= (ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T
= 529×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
2、按样本质量计算
活性单位定义：37℃条件下，每克组织每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。NCR ((nmol/min/g 质量)= (ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=265×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
ε：还原型细胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1010μL=0.00101L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中粗酶液体积，50μL=0.05mL；V 样总：样本处理中最后加入试剂二体积，0.5mL；W：样本质量，g；T：反应时间， 2min。
注意事项：
1、如果测定吸光值 A＞1.2 或 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2、如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。
