产品组成：

溶液的配制：

工作液的配制：临用前将试剂一加入试剂二中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min。

产品说明：

GDH（EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

GDH催化NH +、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD+，引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：

取1mL工作液和0.05mL样本于光径为1 cm的1mL石英比色皿中，混匀，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

三、GDH 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=675×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=675×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.35×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.05×10-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、当ΔA大于0.5时，将样本进行稀释后测量。
2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。