柠檬酸（CA）含量检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 90 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 10 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 0.1 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 支 | 常温保存 |
试剂五 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准液 | 液体 1 mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂四：临用前配制，加入 5 mL 试剂一，充分溶解。
2、标准品：1 mmol/L 柠檬酸标准液。临用前用蒸馏水稀释成 250 μmol/L 柠檬酸标准液。
产品说明：
CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样本中柠檬酸含量。
技术指标：
最低检出限：19.93 μmol/L
线性范围：31.25-4000 μmol/L
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、液体样本中柠檬酸提取：取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g/min 4℃离心 10min，取上清液， 待测。
2、组织中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，11000g/min 4℃离心 10min，取上清液，待测。
3、线粒体中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，600g/min 4℃离心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min，4℃离心 10min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）；向沉淀中加试剂二 200μL，以及试剂三 2μL，充分悬浮溶解，11000g/min，4℃离心 10min，取上清液，待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长到545nm，蒸馏水调零。
2、试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。
3、操作表（按下表在1.5mLEP管中加入相应试剂）：
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 | 标准管 |
蒸馏水 | 100 | | |
上清液 | | 100 | |
标准品 | | | 100 |
试剂一 | 700 |
试剂四 | 100 |
试剂五 | 100 |
充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管、A测定管、A标准管。 |
三、柠檬酸含量计算
1、按液体样本的体积计算
柠檬酸含量（mmol/L）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×F
=2.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
C标准液：标准品的浓度，250μmol/L=0.25mmol/L；F：样本稀释倍数，（0.1mL样本+0.9mL试剂一）÷0.1mL
样本=10。
2、按组织质量计算：
柠檬酸含量（μmol/g 质量）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W
=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
C标准液：标准品的浓度，250μmol/L；V总：上清液总体积，1.0mL=0.001L；W：样本质量，g。3、按线粒体蛋白浓度计算：
柠檬酸含量（μmol/mg prot）=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)] ×V样÷（Cpr×V样）
=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
C标准液：标准品的浓度，250μmol/L=0.25μmol/mL；V样：加入的样本体积，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL。
注意事项：
1、样本处理等过程均需要在冰上进行。
2、试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。
3、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织进行测定。
4、若反应30min后有明显的黑色小颗粒，属于正常现象，需将样本稀释后再测。
5、如果样本吸光值大于0.8，建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
