NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 250 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2、试剂三：临用前加入 300 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一， 催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH， NADP-MDH主要存在于真核细胞中。
NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 试剂一置于37℃水浴中预热15min以上（保证无沉淀）。
3、 操作表：
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
样本 | 20 | - |
蒸馏水 | - | 20 |
试剂一 | 760 | 760 |
试剂二 | 10 | 10 |
试剂三 | 10 | 10 |
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，充分吹打混匀后立即记录 340nm 波长下初始吸光度 A1 和反应1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA 空白=A1 空白-A2 空白，ΔA 测定=A1 测定-A2 测定，计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。（空白管测 1-2 管即可）
三、NADP-MDH活力单位的计算
1、血清（浆）NADP-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。NADP-MDH（U/mL）=ΔA÷ε÷d×V反总÷V样÷T×109=6430×ΔA
ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.0008L；V样：加入样本体积，0.02mL；T：反应时间，1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2、组织中NADP-MDH活力的计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反总÷（Cpr×V样）÷T×109= 6430×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V反总÷（W×V样÷V提取）÷T×109=6430×ΔA÷W
ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.0008L；V样：加入样本体积，0.02mL；V提取：提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
3、细菌或培养细胞中NADP-MDH活力的计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（U/104 cell）=ΔA÷ε÷d×V反总÷（200×V样÷V提取）÷T×109=12.8×ΔA
ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.0008L；V样：加入样本体积，0.02mL；V提取：细胞提取液体积，0.4mL；200：细菌或细胞数量，200万；T：反应时间，1min；109： 单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、样本的提取必须在 0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃放置。
3、建议一人加样一人比色。尽量保持反应温度为 37℃。
