酪氨酸酶活性检测试剂盒说明书 （可见分光光度法）

产品组成：

溶液的配制：
试剂一：临用前每瓶加入 16 mL 提取液充分溶解待用，现配现用。溶解后易氧化，24h 要尽快用完。

产品说明：
酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶，是具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，也是引起果蔬酶促褐变的主要因素，同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响
酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，进而测定出酪氨酸酶的活性。
Tyrosinase

L-Dopa Dopachrome (475nm)
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、细胞超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。12000g，4℃离心 20min，取上清， 置冰上待测。
3、血清（浆）：直接检测。若有浑浊则离心后去上清使用。

二、测定步骤
1、分光光度计预热30min，波长调至475nm。蒸馏水调零。
2、加样表（在1mL玻璃比色皿中分别加入）

将上述试剂分别加入比色皿后迅速吹打混匀，记录第 10s 的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳动物）或 25℃
（其他物种）水浴或培养箱中 3min，拿出迅速擦干测定 3min10s 时的吸光值 A2，计算ΔA =A2 -A1。

三、酪氨酸酶酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。 酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。 酪氨酸酶（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样)÷T=90.09×ΔA÷W
3、按细胞或细菌数量计算：
单位的定义：每104个细胞或细菌每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。 酪氨酸酶（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(500÷V提取×V样)÷T=0.18×ΔA
4、按血清（浆）体积计算：
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。 酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷V样÷T=90.09×ΔA
V反总：反应总体积，10-3L；ε：多巴色素的摩尔消光系数：3.7×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；109： 单位换算系数，1mol=109nmol；V样：加入的样本体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g； V提取：提取液体积，1mL；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，3min。
注意事项：
当ΔA大于0.3时，建议将样本用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增 加加入的样本体积来测定。计算时注意同步修改计算公式。