莽草酸脱氢酶（SD）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）
产品组成：
规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液：内含不溶物，用前摇匀。
2、试剂二：临用前加入 10 mL 蒸馏水溶解。
3、试剂三：临用前每瓶加入 11 mL 蒸馏水溶解。
4、工作液的配制：根据用量按照试剂一：试剂二：试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀，现用现配，用前 25℃预热 15min。
产品说明：
莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。
莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH，检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液（加入前摇匀））进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、液体：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：
试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
工作液（μL） | 950 | 950 |
样本（μL） | | 50 |
蒸馏水（μL） | 50 | |
加入样本即开始计时，充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2， 计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管（空白管只需做 1-2 次）。 |
三、SD酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T=643×ΔA÷Cpr 2、按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=643×ΔA÷W
3、按细胞数量计算
酶活定义：每104个细胞每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T
=643×ΔA÷细胞数量（万个）
4、按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T=643×ΔA
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10-3L；V 样：反应体系中样本体积，0.05mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min；109： 单位换算系数，1mol=109nmol；V样总：加入提取液体积，1mL。
注意事项：
1、样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议2h内测完。
2、样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
3、ΔA大于1时，建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（10min或15min）来测定。
4、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。
