NADH 氧化酶（NOX）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 25 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 0.5 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体 70 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 液体 10 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
试剂六：临用前加入 9 mL 双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。
产品说明：
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD+。该酶不仅参与NAD+的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD+，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆 600g，4℃离心 5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
3、将上清液转移至另一 EP 管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露 NOX 活性测定。
4、沉淀即为线粒体，加入 200μL 试剂二和 2μL 试剂三，反复吹打充分混匀，用于 NOX 活性测定，并用于蛋白浓度测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2、试剂四37℃保温放置。
3、加样表如下：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂四 | 700 | 700 |
试剂五 | 100 | 100 |
样本 | 40 | 40 |
蒸馏水 | | 160 |
试剂六 | 160 | - |
将上述试剂按顺序在 1mL 玻璃比色皿中操作，加入试剂六后立即混匀，同时开始计时，在 600nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 1 分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录 1 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A1-A2，记录 ΔA 测定、ΔA 对照，ΔA=ΔA 测定-ΔA 对照。
三、NOX 活力单位的计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(Cpr×V样)÷T=2500×ΔA÷Cpr
V反总：反应总体积，1mL；V样：加入样本体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1min。
注意事项：
1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。
2、比色皿中反应液的温度最好保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、实验时，试剂六样本在冰上放置，以免变性和失活。
5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6、附：使用样本鲜重计算公式：
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。NOX 上清（U/g 质量）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX 沉淀（U/g 质量）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T=505×ΔA2÷W
NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应总体积，1mL；V 样：加入样本体积，0.04mL；V 提取： 加入试剂一体积，1.01mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
