谷草转氨酶（GOT/AST）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 30 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 8 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 80 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准液 | 液体 1 mL×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前每瓶用 4 mL 蒸馏水溶解；现用现配；
2、标准液：20 μmol/mL 丙酮酸钠。
产品说明：
谷草转氨酶又叫天门冬氨酸氨基转移酶（ 2.6.1.1），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化可逆转氨基反应，是氨基酸代谢的重要酶。此外，GOT在心肌细胞中含量最高，临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。
GOT催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸；丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙，在碱性条件下显棕红色；测定505nm吸光度的变化， 即可计算GOT酶活力。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细胞或细菌样本的制备：
先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。3500g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。3500g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。
2、标准曲线的测定：首先将标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL，按下表混合标准品和试剂一得到相应浓度度标准管：
标准品（μL） | 试剂一（μL） | 标准管浓度（μmol/mL） |
90 | 30 | 1.5 |
60 | 60 | 1 |
48 | 72 | 0.8 |
24 | 96 | 0.4 |
12 | 108 | 0.2 |
6 | 114 | 0.1 |
3 | 117 | 0.05 |
0 | 120 | 0 |
3、在EP 管中加入下列试剂
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
待测样本 | 20 | | |
试剂一 | 100 | 100 | |
标准液 | | | 120 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）反应30min
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴20min
混匀，室温放置10min，在505nm波长处，测各管吸光度。
注：0μmol/mL 标准管为空白管。
三、GOT 活性计算
1. 标准曲线的绘制：以各标准溶液浓度为x轴，以?A（A标准管-A空白管）为y轴做标准曲线，得到方程y=kx+b。将（A测定管-A对照管）带入方程求x值。
2. GOT活性计算：
（1） 按样本质量计算：
单位定义：每小时每g样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT（U/g 质量）=x×（V样本+V试剂一）÷（W×V 样本÷V 样总）÷T=12x÷W
（2） 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT（U/mg prot）=x×（V样本+V试剂一）÷（Cpr×V 样本）÷T=12x÷Cpr
（3） 按血清体积计算：
单位定义：每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT（U/mL）=x×（V样本+V试剂一）÷V 样本÷T=12x
（4） 按细胞数量计算：
单位定义：每小时每104个细胞样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT（U/104 cell）=x×（V样本+V试剂一）÷（V样本÷V 样总×500 ）÷T=0.024x
V样本：吸取样本体积，0.02mL；V试剂一：吸取试剂一体积，0.1mL；V样总：吸取提取液体积，1mL；W： 样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，0.5h；500：细胞或细菌数量，500万。
