谷胱甘肽还原酶（GR）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 3 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂三：临用前加入 5.0 mL 蒸馏水，混匀。
产品说明：
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR催化 GSSG 还原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。
GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP+；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰， 相反 NADP+在该波长无吸收峰；通过测定 340nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、匀浆器/研钵、1mL 石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称约 0.1g 组织，加入 1.0 mL 试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min，取上清液，待测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min 以上。
3、空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 50μL 试剂二，100μL 试剂三，850μL 试剂一，于 340nm 测定 10s 和 190s
吸光度，记为 A 空 1 和 A 空 2。
4、测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 50μL 试剂二，100μL 试剂三，100μL 上清液，750μL 试剂一，于 340nm 测定 10s 和 190s 吸光度，记为 A 测 1 和 A 测 2。
注：样本测定 10s 时吸光度后，将比色皿放入 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）水浴，3min 后拿出，吸
打混匀，立即测定 190s 时的吸光度。
三、GR 活性计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/mg prot)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷[Cpr×V 样]÷T
=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷Cpr
- 按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化为一个酶活力单位。GR 酶活(U/g 质量)= [ (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106] ÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W
ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2；ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1000μL=0.001L；106：单位换算系数，1mol=106μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL =0.1mL；V 样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，3min；W：样本质量，g。
注意事项：
1、样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
2、试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上；
3、测定前须先用 1-2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2-5 倍；
4、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。
