γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品组成：

溶液的配制：
工作液（在试剂一瓶中配制）：临用前配制，把试剂二倒入试剂一瓶中，充分溶解（室温过低时可以 40℃
水浴促进溶解）；然后把试剂三倒入试剂一瓶中，混匀后室温保存。
产品说明：
γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。
γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405nm有特征光吸收； 通过测定405nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 样本，加提取液 1.0 mL 充分研磨，于 4℃，10000rpm 离心 15min，取上清液待测。
3、血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
2、 试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min以上（保证无沉淀）。
3、 样本测定：

混匀后于 405nm 测定 10s 时的吸光度，吹打混匀后测量 130s 时的吸光度，记为 A1 和 A2。计算 ΔA 测定管=A
测 2-测 A1，ΔA 空白管=A 空 2- A 空 1，计算 ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。
三、γ-GT活性计算
1、 按样本蛋白浓度计算：
活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×106×V反总÷（Cpr×V样）÷T=0.506×ΔA÷Cpr 2、 按样本质量计算：
活性单位定义：25℃或者37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×106×V反总÷（W÷V提取×V样）÷T=0.506×ΔA÷W
3、 按血清（浆）体积计算：
活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫升血清每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×106×V反总÷V样÷T=0.506×ΔA
4、 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×106×V反总÷(500×V样÷V提取) ÷T=0.001×ΔA
V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：加入提取液体积：1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500万细胞；ε：对硝基苯胺消光系数，9870L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积，0.001L；106：单位换算系数，1mol=106μmol。
注意事项：
培养细胞中γ-GT活性测定时，细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞（防止因为蛋白质变性导致酶失活）。