蛋白质羰基含量检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）

产品组成：

溶液的配制：
1、试剂一：使用前根据样本数，每支加 2mL 水震荡溶解后离心取上清使用，每支为 10 个样本用量，溶液变黑后即不可再继续使用；
2、试剂五：自备乙酸乙酯和无水乙醇，根据测定样本量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。（提供1 个125mL
空瓶）
产品说明：
    蛋白质羰基化是指氨基酸残基侧链中的氨基或亚氨基受到氧自由基攻击最后转变成醛基，并释放 NH +的过程. 其在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统完成。蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
    羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。
    注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
   天平、恒温水浴锅/培养箱、低温离心机、超声细胞破碎仪、漩涡震荡仪、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇和乙酸乙酯。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
   组织样本：称取约 0.2g 组织样本，加入 2mL 提取液，充分匀浆后于 4℃，5000rpm 离心 10min，取上清（若用蛋白浓度计算最终结果，需要在此步取出 20μL 上清液，加入 2μL 蒸馏水后用于测定蛋白含量，剩余的进行后续步骤），加入 0.2mL 试剂一，室温放置 10min，4℃，12000rpm 离心 10min，取上清待测。
    细菌或细胞样本：收集细胞至离心管内，建议收集 1000~2000 万细胞，加入 2mL 提取液，冰浴超声破碎（功率 200W，超声开 3s，间隔 9s，总时长 3min），于 4℃，5000rpm 离心 10min，取上清（若用蛋白浓度计算最终结果，需要在此步需要在此步取出 20μL 上清液，加入 2μL 蒸馏水后用于测定蛋白含量，剩余的进行后续步骤），加入 0.2mL 试剂一，室温放置 10min，4℃，12000rpm 离心 10min，取上清待测。
    血清（浆）等液体样本：直接测定
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 370nm，试剂六调零。
2. 操作表  

三、计算公式
1、按蛋白浓度计算：
蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）=（A370 测定管-A370 对照管）÷（ε×d）×V÷(Cpr×V 样本) =（A370 测定管-A370 对照管）÷17.6÷Cpr              2、按样本质量计算：
蛋白质羰基含量（μmol/g 质量）=（A370测定管-A370对照管）÷（ε×d）×V÷(W×V 样本÷V 提取) =（A370测定管-A370对照管）÷8÷W              3、按细菌或细胞数量计算：
蛋白质羰基含量（μmol/104 cell）=（A370 测定管-A370 对照管）÷（ε×d）×V÷(细胞数量×V 样本÷V 提取)
=（A370 测定管-A370 对照管）÷8÷细胞数量
4、按液体体积计算：
蛋白质羰基含量（μmol/mL）=（A370 测定管-A370 对照管）÷（ε×d）×V÷V 样本=（A370 测定管-A370 对照管）÷17.6
ε：蛋白质羰基消光系数，22mL/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V：加入试剂六体积，1mL；V 样本：加入样本体积，0.8mL；V 提取：加入提取液及试剂一体积，2.2mL；细胞数量：以万计；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1. 试剂一使用之前根据要测定的样本数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。