二胺氧化酶（DAO）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 0.6 mL×1 支 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 1.5 mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：液体置于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入 6 mL 蒸馏水溶解，4℃可保存 1 个月。
产品说明：
DAO (EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成有色物质，在 500nm 处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算 DAO 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇、研钵/匀浆器、水浴锅。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min， 取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 500nm，蒸馏水调零。
2. 操作表
| 对照管 | 测定管 |
样本（mL） | 0.25 | 0.25 |
提取液（mL） | 0.59 | 0.59 |
试剂一（mL） | 0.01 | 0.01 |
试剂二（mL） | 0.1 | 0.1 |
试剂三（mL） | - | 0.05 |
无水乙醇（mL） | 0.05 | - |
混匀，37℃水浴 30min 后于 1mL 玻璃比色皿中测定 500nm 下吸光度，ΔA=A 测定-A 对照。 |
三、酶活性计算公式
1、组织 DAO 活力的计算
（1） 按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(Cpr×V 样本)÷T=18×ΔA÷Cpr
（2） 按样本质量计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=18×ΔA÷W
2、血清（浆）DAO 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样本÷T=18×ΔA 3、按细胞数量计算
单位的定义：每 104 个细胞在反应体系中每分钟催化产生 1μmol 氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。
DAO（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷（500÷V 提取×V 样本）÷T=0.036×ΔA
ε：氧化型邻联茴香胺消光系数，7.5×10-3mL/μmol/cm；d：1mL 玻璃比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积， 1mL；V 样本：加入样本的体积，0.25mL；V 提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，30min；500：细胞总数，500 万。
注意事项：
1、如果 ΔA 小于 0.01，适当加大提取用样本质量；ΔA 大于 0.8，样本可用提取液适当稀释，或者减少提取用样本质量。
2、样本蛋白质含量需要另外测定。
