抗坏血酸氧化酶（AAO）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解。
产品说明：
AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 样本，加提取液 1.0mL，冰上充分研磨，11000g 4℃离心 20min，取上清液待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。
2、试剂一在25℃水浴锅中预热30min。
3、 按下表依次在石英比色皿中加入试剂
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
蒸馏水 | 100 | |
上清液 | | 100 |
试剂一 | 850 | 850 |
试剂二 | 50 | 50 |
迅速混匀后在 265nm 测定 10s 和 130s 光吸收的吸光值，分别为 A1、A2，用 A1 减 A2，得到 ΔA 空白管、ΔA
测定管。
三、AAO 活性计算
使用1mL石英比色皿测定的计算公式如下
- 按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/mg prot) =(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T
=0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
- 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。AAO(U/g 质量) =(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1000μL=1×10-
3L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V
样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；V样总：加入提取液的体积，1 mL；T：催化反应时间，2min。
注意事项：
由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
