羧酸酯酶（CarE）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

溶液的配制：

1、试剂一：临用前先加入 3.125mL 无水乙醇，震荡使其大部分溶解，再加入 21.875mL 试剂三，震荡至充分溶解。用不完的试剂 4℃保存。

2、试剂二：临用前取 1 瓶试剂二中加入 18mL 试剂三，震荡使其充分溶解。本试剂溶解后为淡黄色，且在常温下不稳定，建议根据样本量取适当配好的试剂二置于冰上待用，剩余试剂分装后置于-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

哺乳动物 CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE 催化含

酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制 CarE 活性。

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固蓝显色；在 450nm 光吸收增加速率，计算 CarE 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液， 超声波破碎细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；然后15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

组织：按照组织质量（g）: 提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

血清：直接测量。

二、测定步骤

2、试剂一置于37℃水浴中预热10 min以上，试剂二在检测过程中需置于冰上待用。

3、在玻璃比色皿中进行如下操作：

将上述试剂按照先后顺序分别加入比色皿中，加入试剂一即开始计时，迅速吹打混匀，测定第 10s 的吸光值记为 A1 空和 A1 测，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中准确反应 5min，之后迅速取出比色皿并擦干， 记录 310s 时的吸光度记为 A2 空、A2 测。计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空，ΔA 测定管=A2 测-A1 测。（空白管只需做 1~2 次）

三、CarE 活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mg组织蛋白每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mg prot)=(ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(Cpr×V样)÷T×F

=4×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr×F

1. 按样本质量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每g组织每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/g 质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(W÷V样总×V样)÷T×F

=4×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W×F

1. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每1万个细菌或细胞每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/104 cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(200÷V细胞样总×V样)÷T×F

=0.008×(ΔA测定管-ΔA空白管)×F

1. 按血清体积计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mL血清每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mL)=(ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷V血清÷T×F

=4×(ΔA测定管-ΔA空白管)×F

V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；200：细菌或细胞总数，200万；V细胞样总：细胞中加入的提取液体积，0.4mL；V血清：加入血清体积，0.05mL；V反总：反应体系总体积，1mL；F：稀释倍数。

注意事项：

1、试剂二为-20℃储存试剂，在常温下不稳定，一般常温放置 2-3 小时后即可明显发现液体由浅黄色变为浅褐色（液体变褐色视为变质，不可用）。建议试验前根据样本量计算所需试剂二的用量，在试剂二溶解后，留取所需用量置于冰上待用，剩余试剂可分装后-20℃储存。