植物中脂氧合酶（LOX）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
粉剂一 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 55 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 6mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。
产品说明：
LOX 广泛存在于植物组织中，特别是黄豆种子中。LOX 催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化。在植物的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。
LOX 催化亚油酸氧化，氧化产物在 234nm 处有特征吸收峰；测定 234nm 吸光度增加速率，来计算 LOX 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 234nm，蒸馏水调零。
2、试剂一在 25℃水浴中预热 30min 以上。
3、空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸馏水、800μL 试剂一和 100μL 试剂二，迅速混匀后于 234nm
比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。空白管只需做 1-2 次。
4、测定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 试剂一和 100μL 试剂二，迅速混匀后于 234nm
比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4。
三、LOX 活性计算
1、按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。LOX (U/mg prot) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(Cpr×V 样)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr
2、按样本质量计算
活性单位定义：在 1mL 体系下，25℃中每克样本每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为一个酶活单位。LOX (U/g 质量) = [(A4-A3)-(A2-A1)]÷0.001÷(V 样÷V 样总×W)÷T×V 反总=10000×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL（需另外测定）；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，
100μL=0.1mL；V 样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间，1min；V 反总：反应体系总体积，1mL。
注意事项：
1、样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日完成酶活性测定。
2、正式实验前做 1~2 个预实验，保证?A 的值在 0.02~1.2 范围内；若反应后为明显的悬浊液，则需稀释后再测。
