硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 90 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 6 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体 30μL×1 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前取 1 瓶加入 3 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃保存 1 周；
2、试剂四：临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释 10 倍后使用。
产品说明：
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH， 是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。
TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成TNB 和 NADP+，TNB 在 412nm 有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与 DTNB同样能反应生成 TNB，因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定 412nm 波长处TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。
2、细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min， 取上清置于冰上待测。
注：测定前将上清液与试剂四以 50：1 的体积比混匀（即取 100μL 上清液加入 2μL 试剂四混合）37℃水浴 30min
后置冰上。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 后，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。
2、试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。
3、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL试剂三，800μL试剂一，迅速混匀后于 412nm 测定 10s
时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310s 吸光度，记为 A1 和 A2。ΔA 空白管=A2-A1。
4、测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL 试剂三，700μL 试剂一，100μL 上清液，迅速混匀后于 412nm 测定 10s 时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310s 吸光度，记为 A3 和 A4。ΔA 测定管=A4-A3。
三、TrxR 活性计算
- 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/mg prot）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d)×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T
=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷Cpr
- 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。TrxR（U/g 质量）=（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷W
- 按细胞数量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。TrxR（U/104 cell）=（ΔA测定管-ΔA空白管）÷(ε×d)×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 147×（ΔA 测定管-ΔA 空白管）÷细胞数量
ε：TNB 在 412nm 处的摩尔消光系数，1.36×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，
1000μL=0.001L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，
100μL=0.1mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；V 样总：提取液体积，1mL；细胞数量：以 104 为单位， 以万计。
注意事项：
1、哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。
2、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
