活丙酮酸脱羧酶（PDC）性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

溶液的配制：

1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀。

2、试剂一的配制：临用前配制，将试剂一 B、试剂一 C 加入到试剂一 A 中并充分溶解。-20℃分装保存，可保存 1 个月。

3、试剂二 B：临用前加入 0.6mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。

4、试剂二 C：临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。

5、试剂二的配制：临用前配制，取 2.625mL 试剂二 A、0.225mL 试剂二 B、0.15mL 试剂二 C 混合（共 3mL， 约 30T），现用现配。

产品说明：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+； NADH在340nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细胞或细菌样本的制备：

2、组织样本：

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。3、血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、根据样本数取适量试剂一、试剂三37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴提前预热30min。

3、操作表：

在比色皿中加入上述试剂后迅速混匀后于 340nm 比色，记录 10s 和 70s 的吸光值，测定管的记为 A1 和 A2， 空白管的记为 A3 和 A4，计算 ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做 1-2 次）

三、PDC活性计算

1、血清（浆）PDC活力的计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1μmol

NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mL）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷V样本÷T=1.6×ΔA

2、 组织中PDC活力的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol

NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mg prot）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷(V样本×Cpr)÷T=1.6×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每g组织质量在反应体系中每分钟催化1μmol

NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷ (W÷V提取×V样本)÷T=1.6×ΔA÷W

3、细菌或细胞中PDC活力的计算： 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol 的NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷(V样本÷V提取×500)÷T=3.2×10-3×ΔA