亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 3 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体 1 mL×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入 7 mL 蒸馏水溶解备用，用不完的试剂 4℃保存；2-8℃保存 4 周。
2、标准品：9 μmol/mL 的亚铁离子标准液。
产品说明：
亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）是铜蓝蛋白的同系物，催化亚铁离子（Fe2+）氧化为三价铁离子（Fe3+），从而三价铁与转铁蛋白结合，参与细胞铁释放。
以一定浓度的 Fe2+ 为底物，在亚铁氧化酶的催化作用下 Fe2+ 被氧化为 Fe3+，Fe2+ 与菲咯嗪形成有色复合物， 在 562 nm 处有特征吸收峰，先计算出未被氧化的 Fe2+ 的含量，进而得出被氧化的 Fe2+ 的含量，可通过 Fe2+ 被氧
化的速率来反映亚铁氧化酶活性。
HP
Fe 2+ Fe 3+
Fe 2+ + 1, 10-Phenanthroline Monohydrate [Fe (phen)3]2+ (562nm)
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g，加入 1 mL 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 10000 rpm，4℃离心 10 min，取上清置于冰上待测。
2、血清或血浆：建议用蒸馏水将血清或血浆稀释 2~4 倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 562 nm，蒸馏水调零。
2、标准液的稀释：将 9 μmol/mL 的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为 360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL 的标准溶液备用。
3、标准液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度（nmol/mL） | 标准液体积（μL） | 蒸馏水体积（μL） | 稀释后浓度（nmol/mL） |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
备注：实验中每个标准管需 100μL 标准溶液。
4、操作表：在 1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂：
试剂名称 | 对照管 | 测定管 | 无基质管 | 空白管 | 标准管 |
蒸馏水（μL） | - | - | 20 | 20 | 20 |
样本（μL） | 20 | 20 | - | - | - |
试剂一（μL） | 280 | 280 | 280 |
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