谷氨酰胺合成酶（GS）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 10 mL×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体 10 mL×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂三：临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃分装保存。
产品说明：
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺， 不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
GS 在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸， 在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、在EP管中加入下列试剂：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 320 | |
试剂二 | | 320 |
试剂三 | 140 | 140 |
样本 | 140 | 140 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min |
试剂四 | 200 | 200 |
混匀，静置 10min 后，5000g，常温离心 10min，取上清液测定 540nm 处的吸光值 A。ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
三、GS 活力单位的计算
- 血清（浆）GS活性
单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =19×ΔA
- 组织、细菌或细胞GS活性
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（Cpr×V样）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.038×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.8mL；V样：加入样本体积，0.14mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：
试剂一、试剂二可能会有析出，可以重悬后使用，反应后取上清测定。
