谷氨酸合成酶（GOGAT）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
工作液的配制：取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入 30 mL 试剂一中溶解，现用现配，可分装后-20℃保存，避免反复冻融。
产品说明：
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。
GOGAT 以 NADH 为电子供体，催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸，NADH 在 340nm
吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、工作液提前配置，平衡至室温。
3、样本测定
试剂名称（μL） | 测定管 |
工作液 | 900 |
样本 | 100 |
混匀，加样本的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 25℃水浴或培养箱中准确反应 5 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 5 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。 |
三、GOGAT 活性计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.5×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GOGAT（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.643×ΔA
V 反总：反应体系总体积，10-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样： 加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol =109nmol。
注意事项：
1、测定期间样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3、当 A1 大于 1.5 或者 ΔA 大于 0.6 时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当 ΔA 过小时，可以延长酶促反应时间
（10min 或 15min）或者加大加入的样本体积进行测量。
4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
