鸟氨酸转氨酶（δ-OAT）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 55 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 70 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加 10 mL 试剂一，充分溶解；用不完的试剂 4℃保存；
2、试剂三：临用前加 10 mL 试剂一，充分溶解；用不完的试剂 4℃保存；
3、试剂四：每瓶临用前加 10 mL 试剂一，充分溶解，-20℃分装保存；-20℃保存一周。
产品说明：
鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶之一，对植物适应逆境胁迫起重要作用。鸟氨酸和 α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH 的作用下，可发生酰基转移反应，生成 NAD 和吡咯醛-5-羧酸（P5C），NADH 在 340 nm 处有特殊吸收峰，通过检测在 340 nm 处吸光度的变化值，可计算出鸟氨酸转氨酶活性高低。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织样本：按质量（g）:提取液体积（mL）1 : 5~10 比例（建议称取 0.1 g 样本，加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后，于 4℃，12000 rpm，离心 10 min，取上清液置于冰上待测；
2、细胞样本：按细胞数量（104）：提取液体积（mL）500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴超声破碎细胞（功率 300 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min）；然后于 4℃，12000rpm，离心 10 min，取上清液置于冰上待测；
3、液体样本：直接测定。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，蒸馏水调零。
2、将配好的试剂二、三、四置于 37℃预热 10 min（用多少，预热多少）。
3、操作表：（在 1 mL 石英比色皿中操作）
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
试剂二 | 300 | 300 |
试剂三 | 300 | 300 |
试剂四 | 300 | 300 |
样本 | 100 | - |
蒸馏水 | - | 100 |
在 1 mL 石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340 nm 处测定 10 s 时的吸光值 A1，迅速置于 37℃ 水浴锅或者 37℃培养箱 10 min，拿出迅速擦干测定 10 min10 s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。空白管只需做 1-2 次。
注意：加入样本时开始计时。
三、δ-OAT 酶活计算
- 按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
δ-OAT（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
δ-OAT（U/g 质量）= ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷W
- 按样本细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
δ-OAT（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷细胞数量
- 按样本液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
δ-OAT（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T= 160.77×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、ΔA 高于 0.5 时，建议将样本稀释后检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。若 ΔA 过小时，可以加大样本量或者延长酶促反应时间。
2、将试剂依次加入后应尽量快速混匀并测定 OD 值，减少误差时间。
3、ΔA 空白管一般不会超过 0.05。
