1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
提取液二 | 液体 0.6 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂一 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 6 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入 2.5 mL 蒸馏水溶解，现配现用，-20℃分装保存，-20℃保存一周；
2、试剂四：临用前每瓶加入 3 mL 蒸馏水溶解，现配现用，-20℃分装保存，-20℃保存一周。
产品说明：
在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下，均会诱导植物体内脯氨酸的积累，对植物起到保护作用。高等植物中，脯氨酸的合成有两条途径，分别以谷氨酸和鸟氨酸为前体。谷氨酸途径主要负责胁迫条件下脯氨酸的积累，而鸟氨酸途径主要在氮充足条件下起作用，与胁迫情况下脯氨酸的积累没有关系。
1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶，P5CS 是一个双功能酶，在 NADPH 和 ATP 作用下，可催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸 γ-半醛还原，通过测定 NADPH 在 340 nm 处吸光度的变化，可计算出 P5CS 的活性高低。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：按质量（g）︰提取液体积（mL）1︰5~10 比例（建议称取 0.1 g 样本，加入 1.0 mL 提取液一）加入提取液一，再加入 10 μL 提取液二，冰浴匀浆后于 4℃，8000 rpm，离心 15 min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，蒸馏水调零。
2、将试剂三、试剂四置于冰上待测。
3、操作表：（在 1 mL 石英比色皿中操作）
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
蒸馏水 | 100 | - |
样本 | - | 100 |
试剂一 | 600 | 600 |
试剂二 | 100 | 100 |
试剂三 | 100 | 100 |
试剂四 | 100 | 100 |
在 1mL 石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340 nm 处测定 10s 时的吸光值 A1， 迅速置于 37℃水浴锅/37℃培养箱放置 5min，拿出迅速擦干测定 5min 10s 时的吸光值 A2，计算 ΔA测定管= A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 |
注意：空白管只需测定 1-2 次。
三、P5CS 酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。P5CS 酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。
P5CS 酶活（U/g 质量）= ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T =324.76×ΔA÷W
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，0.001L；Cpr： 样本蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1.01 mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，5 min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、当 A1 测定高于 1.2 或者 ΔA 大于 0.5 时，建议将样本稀释后检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、尽量使用新鲜样本进行检测，操作时请置于冰上操作。
3、ΔA 空白管的数值一般不超过 0.05。
