羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书 （可见分光光度）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 100mL×1 瓶（自备） | 常温保存 |
试剂一 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准液 | 液体 1 mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1. 提取液：自备 6 mol/L 盐酸。6 mol/L 盐酸的配制：浓盐酸（37%）和 H2O 的体积比是 1：1。
2. 标准液：0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准液。
产品说明：
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样本经酸水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物， 在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样本水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。
技术指标：
最低检出限：0.051 μg/mL
线性范围：0.117-7.5 μg/mL
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约 0.2g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入 2mL 的提取液，煮沸或 110℃ 烘箱 2 至 6 小时消化至没有可见大的团块，冷却后用 10mol/L NaOH（约 1mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），再蒸馏水定容至 4mL。最后 16000rpm，25℃，离心 20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），
取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验）
2. 细胞：取 500 万个细胞，加入 1mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至透明状，冷却后用 10mol/L NaOH（约 0.5mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），蒸馏水定容至 2mL，16000rpm，25℃，离心 20min，取上清待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。
2、将标准液用蒸馏水稀释为 7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117μg/mL 的标准溶液。
3、按下表进行操作：
| 空白管 | 测定管 | 标准管 |
样本（μL） | | 200 | |
标准溶液（μL） | | | 200 |
试剂一（μL） | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温静置 20min |
试剂二（μL） | 200 | 200 | 200 |
H2O（μL） | 600 | 400 | 400 |
混匀，60℃，水浴 20min，取出后室温静置 15 min，用 1mL 比色皿，在 560nm 下分别测定空白管、测定管、标准管的 OD 值，并记为 A 空白管、A 测定管、A 标准管。 |
三、羟脯氨酸含量计算公式
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为 x 轴，?A 标准（?A 标准=A 标准管-A 空白管）为 y 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将?A 测定（?A 测定=A 测定管-A 空白管）带入方程得到 x（μg/mL）。
2. 羟脯氨酸含量的测定：
（1）按样本质量计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/g 质量）= x×V 样本÷（W×V 样本÷V 组提）=4x÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/mg prot）= x×V 样本÷（Cpr×V 样本）=x÷Cpr
（3）按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量（μg/104 cell）= x×V 样本÷（细胞数量×V 样本÷V 胞提）=2x÷细胞数量
V 样本：加入的样本体积，0.2mL；V 组提：组织提取液体积，4mL；V 胞提：细胞提取液体积，2mL；W： 样本质量，g；细胞数量：以 104 为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、 按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。
