羟自由基清除能力检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 55 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 10 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 20 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 20 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体 0.16 mL×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
试剂四：试剂放于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 9.84 mL 蒸馏水混匀，也可按比例现用现配，配好的试剂 2-8℃保存 4 周。
产品说明：
羟自由基是人体在新陈代谢过程中产生的对生物体毒性强、危害大的一种自由基。它可以使组织中的糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质发生氧化，遭受氧化性损伤和破坏，导致细胞坏死或突变。羟自由基清除能力是样本抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+，导致536nm的吸光度下降， 样本536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样本清除羟自由基的能力。
H2O2 + [Fe (phen)3]2+ (536nm) ?OH + [Fe (phen)3]3+
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、 冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织样本的制备：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。
2、血清、果汁等液体样本可直接测定。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。
3、提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如 5mg/mL。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至536nm，蒸馏水调零。
2. 操作表：在1.5mLEP管中分别加入下列试剂
试剂名称 | 空白管 | 对照管 | 测定管 |
试剂一（mL） | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
试剂二（mL） | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
试剂三（mL） | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
充分混匀，防止颜色不均一 |
样本（mL） | - | - | 0.15 |
试剂四（mL） | - | 0.15 | 0.15 |
H2O（mL） | 0.75 | 0.60 | 0.45 |
涡旋混匀，置于 37℃水浴锅/恒温培养箱准确反应 60min。10000rpm，常温离心 10min，取各上清分别测定 536nm 处的吸光度，分别记为 A 空、A 对和 A 测。空白管和对照管只需测定 1-2 次。 |
三、计算公式
羟自由基清除率 D%=（A测-A对）÷（A空-A对）×100%
注意事项：
1. 为了比较不同样本羟自由基清除能力，对于同一批样本必须加入等量的样本，血清、组织匀浆、果汁等液体样本加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。
2. 样本过多时，可以按体积比试剂一：试剂二：试剂三=0.15:0.3:0.3的比例配制工作液，现用现配。
