苯胺-4-羟化酶（AH）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品内容：

产品说明：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型，CYP2E1 不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通过测定630nm 吸光度增加速率，来计算 AH 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、超速离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、1mL 玻璃
比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g，4℃离
心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃
上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加 0.5mL 试剂二，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 630nm，蒸馏水调零。
2、临用前根据实验用量取出部分试剂二在 37℃水浴中预热 30min。
3、试剂五置于冰浴冷却 30min。
4、在 EP 管加入下列试剂：

三、AH 活性计算
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标× V 标×（A 测定管-A 对照管）÷A 标准管×F÷（Cpr×V 样）÷T
= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：37℃条件下，每克组织每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。AH 活性(nmol/min/g 质量) = C 标×V 标×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×F÷(V 样×W)÷T
= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W

C 标：10μmol/L；V 标：500μL=0.5mL；F：稀释倍数，V 反总÷V 上清液=1500μL÷500μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入粗酶液体积， 250μL=0.25mL；W：样本质量，g；T：催化反应时间，30min。
注意事项：
1、如果测定吸光值 A＞1.2 或 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2、如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。
3、粗酶液提取后需在当日完成测定。

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